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体积排阻色谱（SEC）：大分子分离的“分子筛”奥秘
更新时间：2025-03-13
点击次数：307
你是否好奇科学家如何精确分析多肽、蛋白质、聚合物甚至病毒颗粒的分子量？答案就藏在**体积排阻色谱（SEC）**的奇妙世界中！今天，让我们揭开 SEC 固定相的神秘面纱，探索它如何成为实验室的“分子尺子"！
SEC 的原理简单却强大——大分子先出，小分子后出！固定相由多孔填料组成，分子像“赛跑选手"一样穿过孔道：
大分子因体积过大，直接被“拒之门外"，快速洗脱（排阻体积）。
小分子能钻进孔隙“迷宫"，洗脱时间更长（渗透体积）。
下图所示为 SEC 色谱图中化合物尺寸与洗脱的关系。一个常见的误解是 SEC 基于分子量分离分子。大多数情况下确实是这样，分子量较大的分析物通常会先洗脱。不过，更准确的说法是 SEC 基于流体力学体积分离分子，即分子在流动相或溶剂中的有效大小。
SEC 通常分为两种不同的类型：
凝胶过滤色谱法（GFC）：使用水溶液作为流动相
凝胶渗透色谱法（GPC）：使用有机溶剂作为流动相
虽然 SEC 包括 GFC 和 GPC 两种不同类型的分析，但大多数科学家并不对其进行区分。科学家经常交换使用 GPC 和SEC。他们经常会称自己的工作为水相 GPC/SEC 或非水相 GPC/SEC，而不是 GPC 或 GFC。
SEC 色谱柱的固定相可以是硅胶基质或聚合物基质。硅胶基质色谱柱与极性基团（通常为二醇）键合，以防止与分析物产生离子相互作用。聚合物基质色谱柱使用疏水性或极性指数与样品相似的聚合物填料。可以从下表的整理中发现，两种固定相各有各的优劣势。
按照上述对比，我们可以大致得出一个宽泛的结论：高分辨率快速分离、以及常规分析可以优选硅胶基质，且缓冲液+硅胶柱的搭配更适合亲水性生物分子（如蛋白）；对于极-端 pH 或有机溶剂条件，以及分析超大分子（如病毒颗粒、合成高分子）的时候，聚合物基质更优。
SEC 填料为全多孔，通过不同孔径进行分离。孔的体积越大，SEC 填料的分离能力越强。排阻体积（Vo）对应固定相孔排除的化合物洗脱所需的流动相体积。总渗透体积（Vt）是尺寸足够小、可以进入固定相孔的化合物洗脱所需的流动相体积。化合物分离发生在排阻体积与总渗透体积之间。这个体积用填料的总孔体积表示（参见下图）。最终，SEC 填料的孔径将决定色谱柱的排阻范围，或排阻体积与渗透体积之间的对应分子量范围。
基于上述原理，在使用 SEC 的过程中，我们可以利用以下实用攻略：
串联色谱柱：
同孔径串联（如双 50Å 柱）→通过延长柱长提高理论塔板数，增强对分子量接近组分的分离分辨率。
不同孔径串联（如 50Å+1000Å）→扩展分离分子量范围，兼顾小分子片段与大分子聚集体的同步检测。注意需要将大孔径柱置于前端，避免小孔径柱堵塞风险。
选择合适的填料孔径：
需确保目标分子处于填料的线性分离区间（介于排阻极限与渗透极限之间），按照核心公式（经验法则）：
Biozen dSEC-2 & dSEC-7：通过生物惰性系统与亲水化硅胶填料的协同设计，为生物药关键质量属性（CQA）分析提供更灵敏、更稳定的分离平台。
Yarra & Biosep：专为多肽，蛋白质分离而生。
Polysep：聚合物基质搭配 GFC 分析，轻松应对多糖等复杂样本。
Phenogel：聚合物柱的“多面手"，覆盖从 PS（聚苯乙烯）到 PEG（聚乙二醇）的全场景 GPC 需求。
未来展望
随着生物药与复杂制剂（mRNA/AAV/ADC）的爆发式增长，高通量、高精度 SEC 平台已成为研发质控的核心刚需。Phenomenex SEC 色谱技术持续赋能，为生物医药“关键质量属性"提供更优异的分离保障！
