基于电子活化解离技术的市售依那西普生物类似药O-糖基化深度表征与比较

本研究旨在利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术，结合电子活化解离（Electron Activated Dissociation, EAD）碎裂模式，对依那西普原研药及其生物类似药的O-糖基化进行深度表征。研究团队首先在完整蛋白水平，通过去除N-糖链和唾液酸，简化了样品复杂性，鉴定了依那西普单链上的11个O-糖基化修饰及其主要糖型结构（Core 1和Core 2）。其次，在糖肽水平，研究对比了CID与EAD两种碎裂模式，证实了EAD技术在保留糖链完整性的同时能产生丰富的肽段碎片离子，成功实现了对11个O-糖基化位点的精准定位和糖型分析。最后，研究者选取了依那西普原研药（Y1）与来自不同制造商的6种生物类似药或后续产品（Y2-Y7）进行头对头比较。结果显示，不同厂家产品的O-糖基化修饰存在显著差异，其中生物类似药Y2在解卷积质谱、总糖基化分布及特定位点糖基化比例上与原研药为相似。该研究证明了基于EAD的LC-MS方法能为复杂糖蛋白药物的全面质量控制和生产工艺优化提供详尽且精准的数据支持。

本研究选取了依那西普原研药（Y1，Enbrel^®）及6种生物类似药或后续产品（Y2-Y7）作为研究对象。实验设计主要分为完整蛋白分析与糖肽分析两个维度。

在完整蛋白分析方面，为降低异质性干扰，研究者使用了肽-N-糖苷酶F（PNGase F）去除N-糖链，并使用唾液酸酶（Sialidase）去除O-糖链末端的唾液酸。处理后的样品通过ExionLC液相系统耦合BioZen 2.6 µm WidePore C4色谱柱进行分离，随后进入SCIEX ZenoTOF^® 7600高分辨质谱系统进行检测。质谱采集采用飞行时间质谱（TOF MS）模式，扫描范围为600-4000 m/z，利用Biologics Explorer软件进行解卷积分析。

在糖肽分析方面，样品经去N-糖和去唾液酸处理后，进一步进行变性（盐酸胍）、还原（二硫苏糖醇, DTT）和烷基化（碘乙酰胺, IAM）处理。随后，采用胰蛋白酶（Trypsin）和谷氨酰基内切酶（Glu-C）进行联合酶解，以获得适宜长度的肽段。LC-MS/MS分析采用Kinetex 2.6 µm C18色谱柱，在ZenoTOF^® 7600系统上分别使用CID和EAD模式采集数据。EAD模式的关键参数设定为：电子束能量7 eV，反应时间30 ms，并开启Zeno trap（阈值100,000 cps）以提高离子利用率和灵敏度。数据分析允许最多2个漏切位点，O-糖链搜索库包含多达7个取代基，通过特征性的c/z离子系列确证糖基化位点及结构。

在完整蛋白水平，由于依那西普含有多个N-糖基化和O-糖基化位点，直接测定其分子量极其困难。通过酶解去除非保守的N-糖链和带电荷的唾液酸后，质谱图谱得到了显著简化。Biologics Explorer软件的自动匹配结果显示，依那西普单链上主要鉴定了11个O-糖基化修饰。

原研药（Y1）的解卷积质谱图显示了一系列清晰的质谱峰，对应不同数量O-糖链的蛋白形式，质量误差控制在3 Da以内。定量分析表明，含有8个和9个O-糖基化修饰的糖型是主要形式，其相对含量分别为33.77%和36.32%。通过与O-糖链数据库比对，确认依那西普的主要O-糖型为Core 1（半乳糖-N-乙酰半乳糖胺）和Core 2（N-乙酰葡糖胺-半乳糖-N-乙酰半乳糖胺）结构。

详细的数据分析揭示了不同糖型中Core 1和Core 2的具体分布。例如，在包含8个O-糖链的糖型中，主要存在三种组合形式：8个Core 1、7个Core 1加1个Core 2、以及6个Core 1加2个Core 2。通过加权计算，原研药中Core 1修饰的平均数量为8.83个，Core 2修饰的平均数量为0.34个，总O-糖基化修饰的平均数量为9.15个。这一结果表明，通过去糖基化策略，生产商可以在开发过程中快速、准确地测定依那西普的蛋白序列和整体O-糖基化修饰水平。

图1. 原研依那西普（Y1）的解卷积质谱图（A）

和各种 O-聚糖的分布（B）.

为了精准定位O-糖基化位点并解析其微观不均一性，研究者进一步进行了糖肽水平的分析，并重点比较了CID和EAD两种碎裂模式的差异。

在CID模式下，以糖肽SMAPGAVHLPQPVSTR [186-201, S199 Core1]为例，质谱图显示糖链部分的氧鎓离子（oxonium ions）丰度高，表明糖苷键优先断裂。然而，肽段骨架几乎未发生有效碎裂，导致MS/MS离子的覆盖率极低，无法准确判断具体的糖基化位点是S199还是T200。

相比之下，EAD碎裂模式展现了显著优势。在相同的糖肽分析中，EAD模式下糖链部分保持完整，而肽段骨架优先发生断裂，产生了一系列丰富的c离子和z离子（c-ions and z-ions）。该糖肽的序列覆盖率高达93.75%。特别是关键的z2和z3离子的成功检测，明确证实了O-糖基化修饰发生于S199位点。这一结果有力地证明，EAD技术结合Zeno-trap的高灵敏度，不仅能保留糖链与肽段连接的完整性，还能提供详尽的骨架碎片信息，是表征依那西普复杂O-糖基化的理想工具。

利用EAD模式，研究者在依那西普原研药中成功鉴定并定位了11个O-糖基化位点，分别为：T8、T245、S199、T200、T205、T208、S212、T213、S216、T217和S226。这与完整蛋白水平的分析结果高度一致。例如，糖肽LPAQVAFTPYAPEPGSTCR [1-19, T8 Core1]的EAD谱图中，c8、c9、z11和z12离子的检出精准锁定了T8为修饰位点。此外，尽管通常认为CHO细胞的Core 2合酶活性较低，但在本研究的EAD分析中，明确检测到了Core 2型糖链的存在，例如在T245位点鉴定到了Core 2结构。这可能是由于不同制造商的细胞培养条件（如营养浓度、pH值）差异导致Core 2合酶活性上调所致。

研究者进一步对选定的5个代表性位点（T8、S186、S199、T200、T245）进行了糖基化比例的定量分析。结果显示，S199和T200位点在细胞表达过程中极易发生O-糖基化，其修饰比例分别高达86.45%和96.45%。相反，T8、S186和T245位点的修饰程度较低，Core 1修饰比例均低于5%，且未检测到Core 2修饰（注：此处原文表述在Table 2中T245的Core 2比例显示为N/A，但在Table 4中Y1的T245总比例为1.75%，且文中提及T245鉴定到Core 2，需结合上下文理解，可能是指特定糖肽形式或整体平均。根据Table 2数据，T245的Core 2为N/A，但Core 1为1.75%。S186的Core 2为0.25%）。三次独立重复实验计算出的相对标准偏差（RSD）均小于3%，表明该方法具有良好的重现性。

图2. CID (A)和EAD (B) 碎裂模式下糖肽SMAPGAVHLPQPVSTR[186-201, S199 Core2]的

MS/MS 谱图。

图3. EAD模式下具有不同数量O-糖基化位点的糖肽MS/MS谱图。

随着依那西普过期，市场上出现了多种生物类似药。本研究在完整蛋白和糖肽两个层面对原研药（Y1）与6种生物类似药/后续产品（Y2-Y7）进行了深入比较。

在完整蛋白水平，解卷积质谱图直观地展示了各样品的差异。生物类似药Y2和Y3的谱图轮廓与原研药Y1为接近，而其他产品（Y4-Y7）则显示出显著差异。从O-糖链总数的分布来看，Y2和Y3分别主要含有6-10个和6-11个O-糖链，与Y1（6-11个）范围重叠度高。在平均修饰数量上，Y2与原研药为相似，其Core 1平均数量为7.11（Y1为7.47），Core 2平均数量为1.16（Y1为1.02），总平均数量为8.27（Y1为8.49）。相比之下，Y3虽然总糖链数分布相似，但其Core 2修饰的平均数量高达2.82，显著高于原研药，导致总平均糖基化数达到10.63。Y4-Y7样品的总糖基化水平普遍较低（约6.6-6.9），且Core 1与Core 2的比例分布与原研药存在较大偏差，例如Y4和Y7的Core 1与Core 2数量相当，而Y5和Y6的Core 1数量明显多于Core 2。

在糖肽水平，研究者对比了5个关键位点（T8、S186、S199、T200、T245）的糖基化比例，结果进一步印证了完整蛋白水平的发现。生物类似药Y2在所有5个位点的糖基化比例上均与原研药Y1高度一致：T8（4.75% vs 4.56%）、S186（0.66% vs 0.59%）、S199（88.16% vs 86.45%）、T200（96.25% vs 96.45%）和T245（1.52% vs 1.75%）。这表明Y2在分子结构上与原研药高度相似。然而，其他样品表现出显著的特异性差异。例如，Y3、Y4、Y5和Y6在T8位点的糖基化比例异常升高，接近100%（Y3为100%，Y4为99.17%），而原研药仅为4.56%。此外，Y4在S199和T200位点的糖基化比例显著降低（分别为29.84%和70.75%），远低于原研药水平。Y3、Y4、Y6和Y7在T245位点的糖基化比例也大幅升高至24%-27%左右，而原研药仅为1.75%。

这些数据充分说明，不同制造商生产的依那西普在O-糖基化修饰上存在显著差异。这些差异源于生产工艺的不同，如宿主细胞选择、培养条件及纯化工艺等。特别是Core 2结构的差异可能影响TNF受体结构域的构象，进而影响药物与TNF-α的结合亲和力及治疗效果；而过量的Core 2修饰甚至可能作为外以此抗原被免疫系统识别，增加药物的免疫原性风险。因此，Y2被认为是与原研药在O-糖基化方面最相似的生物类似药，而Y3-Y7的安全性与免疫原性需在临床研究中进一步评估。

图4. 通过 LC-MS 分析获得的完整蛋白水平依那西普原研药（Y1）和 6 种生物类似药（Y2-Y7）的解卷积质谱图.

本研究创新性地采用LC-MS结合EAD碎裂技术，对依那西普及其生物类似药的O-糖基化进行了全面的深度表征。

首先，研究建立了一套高效的分析流程。通过酶解去除N-糖和唾液酸，成功在完整蛋白水平测定了依那西普的分子量分布，鉴定了11个O-糖基化位点及Core 1/Core 2两种主要糖型，并计算了其平均糖基化数量（Core 1为8.83，Core 2为0.34）。

其次，研究深入比较了CID与EAD技术在糖肽分析中的表现，确立了EAD技术的优势。结果表明，EAD模式能有效克服CID模式下糖苷键优先断裂的局限，在保留糖链完整性的同时产生丰富的肽段骨架离子（c/z离子），极大提高了序列覆盖率，实现了对O-糖基化位点的精准定位和糖型的定性定量分析。利用该技术，研究者在单次进样中成功鉴定了依那西普单链上的11个具体O-糖基化位点，并发现S199和T200是高频修饰位点。

最后，本研究首利用EAD技术对依那西普原研药与多种生物类似药进行了系统的O-糖基化比对。综合解卷积谱图一致性、总O-糖基化分布及糖肽位点特异性比例，研究确认生物类似药Y2与原研药Y1为相似。相比之下，其他生物类似药或后续产品在糖基化程度和糖型分布上表现出显著的工艺相关性差异。鉴于O-糖基化异质性对药物疗效和免疫原性的潜在影响，这种深度的表征分析对于生物类似药的相似性评价至关重要。