qPCR引物探针纯度如何评估？Biozen Oligo给出方案

在寡核苷酸的应用市场中，诊断行业增长迅速。从核酸检测相关产品和服务的市场规模来看，PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）检测占据核酸检测的主导地位，并呈现递增态势，这主要得益于qPCR（实时荧光定量PCR）这一主流技术的发展。qPCR凭借其灵敏、快速和实时定量的特性，已成为分子诊断、病原体检测及基因表达分析的关键技术之一。

荧光探针法qPCR是临床检测中常用的检测方法，试剂盒中通常包含一对正反向引物及特异性荧光探针。在PCR循环的退火-延伸阶段，引物与模板DNA结合，探针定位于目标序列区域，在延伸过程中通过荧光信号实时反映扩增过程。

引物和探针均为固相合成的单链寡核苷酸，长度通常为18–30个碱基。根据GB/T 34797—2017标准，可采用质谱法或高效液相色谱法进行纯度检测。本文基于Biozen Oligo色谱柱，构建了一套离子对-反相液相色谱（IP-RPLC）方法，实现多种qPCR引物和探针的高效纯度分析。

注：1，2，3代表三种模板基因，F为正向引物，R为反向引物，P为荧光探针

• 色谱柱：Biozen Oligo（2.1 × 100 mm, 1.7 μm, 100 Å）；P/N: 00D-4791-AN

• 流动相：

  A：100 mM 六氟异丙醇+ 15 mM 三乙胺

  B：甲醇

• 流速：0.25 mL/min

• 检测波长：260 nm

• 柱温：50 ℃

• 进样量：1 μL（50 nmol）

图1. 1-F谱图（右图为局部放大）

图2. 1-R谱图（右图为局部放大）

图3. 1-P谱图（右图为局部放大）

图4. 2-F谱图（右图为局部放大）

图5. 2-R谱图（右图为局部放大）

图6. 2-P谱图（右图为局部放大）

图7. 3-F谱图（右图为局部放大）

图8. 3-R谱图（右图为局部放大）

图9. 3-P谱图（右图为局部放大）

引物、探针纯度分析结果