快码住！带你用Biozen native RP玩转DAR

对于未知ADC样品，建议先使用Biozen™ Native RP-5建立整体DAR分布，观察DAR ladder的主分离窗口；如果低DAR物种保留不足，再进一步评估Biozen™ Native RP-1。

当payload疏水性较弱，或特别关注DAR0保留并希望与buffer区域分开时，也可以优先评估Biozen™ Native RP-1。

图1. Biozen™ Native RP-1与Biozen™ Native RP-5对比谱图

不同Native RP柱化学会影响早洗脱DAR物种的保留。RP-5适合建立整体DAR ladder；RP-1可用于增强DAR0和低DAR物种的保留。

如果 DAR ladder 整体分离不足，首先建议拉缓主分离梯度，尤其是 15–50%B 或等效主分离区间。同时可进一步比较 Biozen™ Native RP-1 / RP-5、盐浓度、pH 和有机相类型。

需要注意的是，Native RP 方法中不能只看仪器方法里的 %B。推荐体系中，B 相通常为 IPA / 50 mM Ammonium Acetate = 50/50，v/v。因此，50%B 对应的真实 IPA 含量为 25%。主分离窗口通常不建议超过真实 IPA 25%，100%B 更多用于短暂清洗疏水残留。

通常不建议只依赖拉长梯度。DAR0 是低疏水性的 ADC 物种，与反相固定相的相互作用较弱，因此更容易靠近死时间洗脱。如果样品中含有盐、糖、表活或其他制剂辅料，也可能进一步影响早洗脱区域背景和 DAR0 保留。

DAR0保留不足时，更建议按照以下顺序判断：

• 是否需要从 Biozen™ Native RP-5 切换到 Biozen™ Native RP-1；

• 是否需要降低流动相盐浓度；

• 初始真实 IPA 是否过高；

• 样品 buffer 或制剂辅料是否影响早洗脱区域；

• 是否需要从两相体系切换到三相体系。

在 Biozen™ Native RP 方法中，盐浓度会影响 DAR 物种的保留和选择性。对于 DAR0 或低 DAR 物种保留不足，可尝试降低 ammonium acetate 浓度，例如从 20–25 mM 继续向低盐范围筛选，必要时可评估 5–10 mM。

经验上，低离子强度通常更有利于早洗脱 DAR 物种的保留和分离。因此，当 DAR0 在 Biozen™ Native RP-5 上接近不保留时，可以优先考虑 Biozen™ Native RP-1 + 低盐条件。

图2. 不同盐浓度下低 DAR 区域对比谱图

当 DAR0 与 buffer 或早洗脱基质区域重叠时，两相体系的调节空间可能不够。因为在两相方法中，盐浓度、有机相比例和梯度变化往往被绑定在一起，难以单独调节方法初始阶段的保留环境。

三相体系的优势在于，可以把初始盐浓度、水相比例和后续 IPA 梯度分开控制，从而更精细地调节 DAR0 的保留和峰形。

这一部分建议作为文章的核心展开，并配合谱图和方法表呈现。正文不需要过度解释机理，重点让读者一眼看到“两相变三相"的核心变化。

图3. 两相方法 vs 三相方法对比谱图

两相体系中 DAR0 可能靠近 buffer 或早洗脱基质区域；切换至三相体系后，可通过初始低盐水相增强 DAR0 保留，再进入含 IPA 的主分离梯度，从而改善 DAR0 与早洗脱区域的区分度。

图4. 三相方法梯度表

Biozen™ Native RP 方法中，不能只看仪器方法里的 %B 或 %C，更要计算真实 IPA。例如 C 相为 IPA / 50 mM Ammonium Acetate = 50/50，v/v，因此 50%C 对应真实 IPA 25%。

如果真实 IPA 过高，可能影响 ADC intact/native 状态，也可能导致早洗脱物种保留进一步降低。对于 DAR0 或裸抗峰形拖尾的情况，可以在初始条件中加入少量 IPA，但建议从真实 IPA 1–3% 起筛，而不是盲目提高有机相比例。

会，尤其是制剂样品或 LC-MS 分析。盐、糖、表活和其他辅料可能影响早洗脱区域背景，也可能影响 MS 响应。

如果进行 LC-MS 分析，建议进行 buffer exchange，例如置换至 20 mM Ammonium Acetate pH 5.2，或 20 mM Ammonium Formate pH 5.0，以减少制剂组分对 MS 源的污染，并改善靠近死时间洗脱的 DAR0 灵敏度。

对于 UV 方法，也建议完整记录样品 buffer、浓度、上柱量和稀释方式。这样在后续判断保留变化时，才能区分是色谱条件变化，还是样品基质变化引起的。

Biozen™ Native RP 方法优化并不是简单地提高有机相或拉长梯度，而是围绕柱化学、盐浓度、真实 IPA、三相体系和样品前处理建立系统判断。

对于 ADC intact DAR 分析，可以先用 Biozen™ Native RP-5 建立整体 DAR ladder，再根据低 DAR 区域表现评估 Biozen™ Native RP-1。当 DAR0 靠近死时间或与 buffer 区域重叠时，从两相体系切换到三相体系，往往能够为早洗脱区域提供更精细的调控空间。