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如何选择合适的离子对搞定oligo杂质？
更新时间：2025-06-06
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2023年8月22日，小干扰RNA(siRNA)降胆固醇药物英克司兰钠注射液(乐可为®，Inclisiran)在递交新药申请9个月后获NMPA批准上市，为中国心血管疾病患者的长期血脂管理带来了前沿、依从性更高、更便捷的治疗方案。
图1. 英克司兰的结构[1]
英克司兰是一种硫代修饰的寡核苷酸，将原有磷酸键中一个非桥连的氧原子用硫原子来置换。加入硫代磷酸酯键后寡核苷酸的稳定性更好，能抵抗核酸酶的降解，因此有效地增加了寡核苷酸在细胞环境中的半衰期。虽然寡核苷酸的稳定性得到增强，但引入每个硫代磷酸酯键都会引入一个手性中心，因此含n个硫代修饰的寡核苷酸理论上存在 2ⁿ 种立体异构体（如20-mer硫代寡核苷酸可能有上百万种异构体）。
硫代寡核苷酸在液相色谱分析中常出现峰展宽现象，推测是由于理化性质上存在的细微差异会导致非对映异构体在色谱柱固定相上得到部分分离，所以硫代磷酸酯寡核苷酸的色谱峰比其天然（磷酸二酯）对应物的色谱峰宽[2]。
在一些文献中，我们也可以看到有一些规律[3]，图2是相同的核酸序列，不同硫代个数的寡核苷酸样品，在不同的离子对试剂条件下的峰形对比。对于弱的离子对试剂，非对映异构体的分离更加明显，而对于强的离子对系统则表现出抑制效果。因此学者假设非对映异构体的分离是由于与C18固定相的疏水相互作用造成的，在使用亲水性烷基胺的离子对反相液相色谱中，低浓度的ACN时更为明显。强的离子对试剂需要高浓度的ACN来洗脱寡核苷酸，这导致非对映异构体的分离减少。一些相关实验同时也表明，PS寡核苷酸峰的宽度大于所有IP系统中的PO寡核苷酸。
图2. 同一序列的21聚体寡核苷酸的分离（1-无硫代；2-一硫代；3-二硫代；4-四硫代；5-六硫代）在可比较的时间窗口（保留时间约10分钟）内实现寡核苷酸洗脱的峰形对比。
针对上述现象，本文开发一种色谱条件能够抑制硫代磷酸酯寡核苷酸非对映异构体的峰展宽，同时使全长硫代磷酸酯寡核苷酸（n）和其序列长短异构体（n+1和n-1）以及硫代不异构体得到良好的分离，参见图3和图4。
图3. AS链以及其失败序列的单标叠图（深蓝色：AS-1nt；；浅蓝色：AS-1S；黑色：AS；绿色：AS+1nt）
图4. SS链以及其失败序列的单标叠图（深蓝色：SS-1nt；；浅蓝色：SS-1S；黑色：SS；绿色：SS+1nt）
采用Phenomenex的BioZen Oligo 是一种专为寡核苷酸分析设计的色谱柱，除了拥有了先进的核-壳颗粒技术和有机硅胶杂化工艺，还引入了BioTi生物兼容性硬件，提高了色谱柱在低进样量分析时的灵敏度和稳定性，特别是在处理生物样品中寡核苷酸的表征和定量时。这种硬件改进有助于改善回收率，对于治疗性寡核苷酸药物的研发和质量控制至关重要。
参考文献
[1] Oligonucleotide Therapeutics — A New Class of Cholesterol-Lowering Drugs. N Engl J Med. 2017; 376(1):4-7.
[2] Z. Kadlecova, K. Kalíkova, E. Tesarova, M. Gilar, Phosphorothioate oligonucleotides separation in ion-pairing reversed-phase liquid chromatography:effect of ion-pairing system, J. Chromatogr. A 1676 (2022) 463201.
[3] Z. Kadlecov´a, K. Kalíkov´a, E. Tesaˇrov´a, M. Gilar, Phosphorothioate oligonucleotides separation in ion-pairing reversed-phase liquid chromatography: effect of ion-pairing system, J. Chromatogr. A 1676 (2022) 463201
